PCR基因擴增儀反應體系的組成及其作用

  PCR（Polymerase Chain Reaction）反應，中文譯為聚合酶鏈式反應，是一種在體外（試管、切片…）擴增核酸的技術(shù)。PCR的基本反應包括以DNA為模板的反應和以mRNA為模板的反應。
PCR反應是模擬體內(nèi)天然DNA（脫氧核糖核酸）的復制過程。以擴增DNA為例，其基本原理是在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應。
PCR反應一般設(shè)置20～40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板。PCR的擴增效率很高，如果循環(huán)次數(shù)是30次，那么新生DNA片段理論上達到230拷貝（約為109個分子）。
PCR反應每個循環(huán)的三個基本反應步驟如下：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：溫度升到72℃左右，DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。
重復循環(huán)變性－－退火－－基因擴增儀https://www.jntckj.cn/延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期（Plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性。

PCR反應體系的組分及各組分的作用總體積：一般為25μl～100μl一、Mg2+:終濃度為1.5～2.0mmol/L，其對應dNTP為200?μmol/L，注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系，由于dNTP與Taq酶竟爭Mg2+，當dNTP濃度達到1?mmol/L時會抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影響反應的特異性和產(chǎn)率。二、無Mg2+buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度，但不能超過50?mmol/L，否則會抑制DNA聚合酶活性。三、BSA：一般用乙酰化的BSA，起著減少PCR管對Taq酶的吸附作用，對Taq酶有保護作用。四、底物（dNTPs）：dNTPs具有較強酸性，其儲存液用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.5，一般存儲濃度為 10 mmol/L，各成份以等當量配制，反應終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應，但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高性，而反應速度會降低。五、Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其適pH值為8.3～8.5，適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補原則為基礎(chǔ)，按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3’→5’的外切酶活性，沒有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過高,會增加其錯配率。基因擴增儀用量一般為0.5～5個單位/100μl。六、模板：PCR對模板DNA的純度不要求很高，但應盡量不含有對PCR反應有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高，否則擴增可能不會成功，在此情況下可適當稀釋模板。七、引物：引物濃度一般為0.1～0.5μmol/L，濃度過高會引起錯配和非特異擴增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度一般15～30個堿基，引物過長或過短都會降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對，末位堿基選用A、C、G（因T錯配也能引發(fā)鏈的延伸）。引物G+C約占45～55%，堿基應盡量隨機分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應有互補鏈存在，不能與非目的擴增區(qū)有同源性。